Resumen

La O6-alquilguanina-ADN alquiltransferasa humana (hAGT) es una proteína reparadora del ADN que revierte los efectos de los agentes alquilantes eliminando los aductos de ADN de la posición O6 de la guanina. En este trabajo desarrollamos un ensayo de fluorescencia en tiempo real de la actividad de la hAGT basado en la detección de cambios conformacionales del aptámero de unión a trombina (TBA). La estructura cuadruplex del TBA se altera cuando se sustituye una guanina central por una O6-metil-guanina. La secuencia también contiene un fluoróforo (fluoresceína) y un amortiguador (dabsilo) unidos a los extremos opuestos. En la estructura desplegada, el fluoróforo y el quencher están separados. Cuando la hAGT elimina el grupo metilo de la guanina central de la TBA, ésta se pliega inmediatamente en su estructura cuadruplex. En consecuencia, el fluoróforo y el quencher se aproximan, lo que provoca una disminución de la intensidad de la fluorescencia. Aquí hemos desarrollado un nuevo método para cuantificar la hAGT sin utilizar radiactividad. Este nuevo ensayo de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia se ha diseñado para detectar el cambio conformacional de la TBA inducido por la eliminación del grupo O6-metilo.

• Materias:Pliegue de Proteína Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Ácidos nucleicos Reparación del ADN Daño del ADN
• Subjects:Protein Folding Polymerase chain reaction Nucleic acids DNA Repair DNA Damage
• Palabras claves:tba, fluoróforo, quencher, guanina central, grupo metilo, estructura cuadruplex, nuevo ensayo de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, proteína reparadora del adn, ensayo de actividad hagt, guanina
• Keywords:tba, fluorophore, quencher, central guanine, methyl group, quadruplex structure, new fluorescence resonance energy transfer assay, dna repair protein, hagt activity assay, guanine