Resumen

Los sistemas de knockout de múltiples genes desarrollados en el crenarqueón termoacidófilo Sulfolobus acidocaldarius son potentes herramientas genéticas. Sin embargo, la construcción de plásmidos suele requerir varios pasos. También se ha desarrollado en S. acidocaldarius la técnica de PCR tailing para la disrupción génica de alto rendimiento, pero el knockout génico repetido basado en PCR tailing ha sido limitado debido a la falta de un sistema de marcadores genéticos. En este estudio, demostramos una frecuencia de recombinación homóloga eficiente (2,8 × 104 ± 6,9 × 103 colonias/μg de ADN) mediante la optimización de las condiciones de transformación. Este protocolo optimizado permitió desarrollar un knockout génico fiable a través del doble cruce utilizando brazos homólogos cortos y establecer el sistema de knockout génico múltiple con PCR de un solo paso (MONSTER). En el MONSTER, un casete de knockout génico múltiple se construyó de forma sencilla y rápida mediante PCR de un solo paso sin necesidad de construir un plásmido, y el producto de la PCR puede utilizarse inmediatamente para la eliminación del gen diana. Como ejemplo de las aplicaciones de esta estrategia, hemos creado con éxito una cepa de S. acidocaldarius deficiente en ADN fotoliasa (phr-) y arginina descarboxilasa (argD-). Además, también se estableció un sistema de selección de agmatina consistente en una cepa agmatina-auxotrófica y un marcador argD. El MONSTER proporciona una estrategia alternativa que permite la construcción muy sencilla de casetes de eliminación de múltiples genes para estudios genéticos en S. acidocaldarius.

• Materias:Dióxido de carbono Genes Metabolismo (Bioquimica) Arqueas metanogénico
• Subjects:Carbon dioxide Genes Metabolism (Biochemistry) Archeas methanogenic
• Palabras claves:gen múltiple, construcción de plásmidos, pcr de paso, frecuencia de recombinación homóloga, crenarchaeon sulfolobus acidocaldarius, sistema de selección con agmatina, sistema de marcadores genéticos, disrupción génica de alto rendimiento, herramientas genéticas potentes, knockout génico repetido
• Keywords:multiple gene, plasmid construction, step pcr, homologous recombination frequency, crenarchaeon sulfolobus acidocaldarius, agmatine selection system, genetic marker system, throughput gene disruption, powerful genetic tools, repeated gene knockout