Resumen

Se implementó una prueba de tamizaje preliminar para evaluar la potencial inhibición ejercida por productos de origen natural y sintético sobre la actividad de la proteína Transcriptasa Reversa del virus VIH-1, en respuesta a la necesidad de disponer de un ensayo in vitro no radioactivo, relativamente rápido, que arroje resultados válidos, con costos moderados, bioseguro y de fácil acceso. Esta prueba se basa en la capacidad que tiene la proteína transcriptasa reversa viral para formar DNA de cadena sencilla (cDNA) a partir de RNA, utilizando deoxinucleótidos trifosfatados (dNTPs), proceso conocido como transcripción reversa. Para detectar la actividad de la proteína se realizaron ensayos fluorométricos in vitro, usando proteína recombinante sin purificar, y nucleótidos fluorescentemente marcados (Cy3-dCTP) como parte del sustrato. Las condiciones establecidas para la actividad de la proteína fueron 5µg/reacción de RNA total y 2µg/reacción de oligo-dT_12-18, reflejadas en 43.6% de incorporación del nucleótido fluoromarcado.

Introducción

El virus de la inmunodeficiencia humana tipo uno (VIH-1), agente etiológico más agresivo del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA), pertenece a la familia retroviridae, posee dos copias de RNA de cadena sencilla y polaridad positiva y requiere de un intermediario DNA para su proliferación (1). La  replicación del virus se inicia con la transcripción reversa de la cadena viral RNA en una doble cadena DNA, la cual es posteriormente integrada en el DNA cromosomal de la célula hospedadora. Esta etapa proviral de síntesis de cDNA, crítica para el ciclo de vida retroviral, es catalizada por la enzima Transcriptasa Reversa viral (TR). La TR es biosintetizada como un producto del gen Pol, el cual también codifica para las proteínas proteasa (PR) e integrasa (IN). La poliproteína primaria de TR es luego procesada por la pro­teasa para dar un heterodímero de la TR-HIV-1 funcional que contiene las subunidades p66 (66KDa) y pSI (51KDa) (2).

Durante la replicación, la cadena RNA es copiada por la actividad DNA polimerasa dependiente de RNA (PDDR) de la TR, produciendo un híbrido RNA-DNA. La actividad RNAsa-H degrada específicamente el RNA viral del heteroduplex y finalmente la doble cadena de DNA viral es obtenida por la síntesis de la segunda cadena de DNA, por la actividad DNA polimerasa dependiente de DNA (PDDD) de la TR (3). Siendo la TR requerida para la síntesis inicial del DNA proviral, la inhibición de la polimerización de DNA a partir de RNA viral catalizado por TR, inhibe la replicación del virus (4, 5).

La introducción de terapias antiretrovirales ha mejorado la calidad de vida de pacientes con avanzada infección viral y previniendo o deteniendo la progresión de la enfermedad.

• Materias:Virus de Inmunodeficiencia Humana - VIH Fluorometría Enzimas
• Subjects:Human Immunodeficiency Virus - HIV Fluorometry Enzymes
• Palabras claves:VIH-1 - Transcriptasa reversa - SIDA - cDNA - Retrotranscripción; Cy3
• Keywords:HIV-1; Reverse Transcriptase; AIDS; cDNA; Retrotranscription; Cy3.