Resumen

La visualización de ARNm basada en un sistema de traducción sin células presenta las ventajas de un mayor tamaño de la biblioteca y unos procedimientos de selección más rápidos en comparación con los métodos de visualización basados en células, como la visualización de fagos. Sin embargo, la visualización de ARNm se ha limitado a la selección de polipéptidos de cadena sencilla, como los scFv, debido a su característica de unir un polipéptido naciente con su ARNm codificante en el ribosoma. Aquí demostramos una nueva forma de seleccionar fragmentos Fab heterodiméricos mediante el uso de mRNA display combinado con PCR en emulsión. Diseñamos un par de secuencias complementarias 5′ UTR que pueden unir los genes de las cadenas Fab pesada y ligera mediante PCR de superposición-extensión en emulsiones de agua en aceite. Confirmamos que dos polipéptidos mostrados por ARNm para las cadenas pesada y ligera de un fragmento Fab modelo se asociaban en la forma activa y que un gen de fragmento Fab específico se enriquecía más de 100 veces por ronda de una selección de afinidad modelo seguida de la PCR de emulsión de unión de genes. Además, realizamos la evolución dirigida de fragmentos Fab con mayor actividad de unión a partir de una biblioteca aleatoria de fragmentos Fab.

• Materias:Genética molecular Ácido ribonucleico (ARN) Genómica Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Ácidos nucleicos
• Subjects:Molecular genetics Ribonucleic acid (RNA) Genomics Polymerase chain reaction Nucleic acids
• Palabras claves:mrna display, métodos de display, emulsión pcr, biblioteca aleatoria de fragmentos fab, gen específico de fragmentos fab, sistema de traducción libre, fragmentos fab heterodiméricos, mayor actividad de unión, mayor tamaño de la biblioteca, genes de cadenas ligeras
• Keywords:mrna display, display methods, emulsion pcr, randomized fab fragment library, specific fab fragment gene, free translation system, heterodimeric fab fragments, higher binding activity, larger library sizes, light chain genes