Growth kinetics of of Bacillus thuringiensis. Bath fet-bath and continuous bioreactor cultures

Cinética de crecimiento de Bacillus thuringiensis. Cultivos en bioreactores Bath fet-bath y continuos

Las células de Bacillus thuringiensis, durante su fase tardía de crecimiento estacionario, producen tanto esporas como la proteína cristal bioinsecticida delta-endotoxina. Las células de B. thuringiensis también se desarrollan dependiendo de las condiciones ambientales. Así, es necesario adoptar un enfoque extenso para estudiar la cinética de crecimiento de B. thuringiensis considerando, no solamente el crecimiento celular típico, sino los cambios metabólicos que ocurren mientras se producen las esporas y la proteína cristal.

Este documento presenta los resultados del estudio de cinética de crecimiento celular de B. thuringiensis, subespecies kurstaki, cepa HD-1 (ATCC 33679), puesta a crecer bajo condiciones de crecimiento batch (por lotes) y fed-batch (por lotes alimentado). Adicionalmente, se investigó el crecimiento del B. thuringiensis bajo condiciones de estado estacionario continuo en un sistema de biorreactor de 2 L de una etapa y un sistema de biorreactor continuo de dos etapas, el cual consistía en un reactor de 2 L seguido de otro de 15 L.

La microscopía óptica y la microscopía de transmisión de electrones (TEM) se empleó extensivamente en este estudio para medir la morfología y el estado metabólico de las células de B. thuringiensis a diferentes condiciones de crecimiento durante los experimentos batch, fed-batch y continuos en estado estacionario. Se observaron diferencias morfológicas significativas en las células de B. thuringiensis, como una función del tiempo de crecimiento para los experimentos batch, y como función de las velocidades de difusión para los experimentos continuos en estado estacionario.

La separación de la proteína cristal a partir del caldo fermentación para propósitos analíticos presentó serios problemas. Es este estudio, se desarrolló un nuevo método para aislar la proteína cristal, el cual la producía con una pureza superior al 95% ± 5%. Adicionalmente, se empleó Cromatografía Líquida de Alto Desempeño (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) para detectar la proteína. Los resultados experimentales demostraron la alta dependencia de la formación de esporas y proteína cristal con respecto al tipo de cultivo. En los cultivos batch, la formación de esporas y proteínas cristal causó un decrecimiento en la velocidad de crecimiento de la biomasa, reduciendo la concentración de biomasa final. Para los cultivos continuos, se observó una reducción en la concentración de biomasa a bajas velocidades de dilución. Finalmente, en el crecimiento fed-batch, no se produjeron ni esporas ni proteína cristal, aún cuando se redujera completamente el sustrato límite.

Un profundo análisis de los datos experimentales mostró que el modelo cinético de crecimiento clásico no podía predecir exactamente la concentración de biomasa para el intervalo de tiempo completo de un lote y a todas las velocidades de dilución de un cultivo continuo de B. thuringiensis. Así, se desarrolló y se probó exitosamente un nuevo modelo de crecimiento cinético con esporulación, el cual incluye un término representando la velocidad específica de formación de esporas, para los datos experimentales batch y continuo.

Los resultados experimentales fueron empleados también para determinar parámetros cinéticos de crecimiento celular nuevos y confiables (μmax y Ks), así como los coeficientes de rendimiento de crecimiento y velocidad de respiración para cultivos batch y continuos.