Producción y purificación de osteopontina bovina recombinante utilizando Escherichia coli como fábrica celular

Production and purification of recombinant bovine osteopontin using Escherichia coli as a Cell Factory

Los programas de reproducción y mejora animal requieren la optimización de herramientas biotecnológicas capaces de favorecer las tasas reproductivas en diversas especies. El uso de aditivos proteicos que mejoren la criopreservación espermática y la producción de embriones in vitro parece ser una alternativa interesante. La osteopontina se ha relacionado con el potencial fecundante del espermatozoide y el desarrollo embrionario temprano. El objetivo de este trabajo fue determinar las condiciones óptimas para producir Osteopontina recombinante (rOPN) utilizando Escherichia coli como fábrica celular. Para ello, se insertó el gen OPN en un vector de expresión pET28(a+) inducible por IPTG, con resistencia a Kanamicina y una cola de histidina (6xHis-tag). La construcción resultante se utilizó para transformar células E. coli BL21-Star ™ competentes. Las colonias transformadas se utilizaron para producir rOPN-H6 a 20, 30 y 37 °C, probando dos concentraciones del inductor IPTG (1,0 y 0,1mM). Se realizó una purificación de rOPN-H6 utilizando columnas de afinidad de imidazol (10, 50, 200, 350, 500mM). Los resultados mostraron que la producción de rOPN-H6 sólo tenía éxito a 37°C, independientemente de la concentración de IPTG utilizada. La purificación de rOPN-H6 tuvo éxito utilizando imidazol a 200mM, con una aparente tendencia a la dimerización tras la obtención de la proteína purificada. De este modo, se concluye cuáles son las mejores condiciones para obtener OPN recombinante, sugiriendo su uso potencial en ensayos de criopreservación de espermatozoides y medios de cultivo para la producción de embriones in vitro.

INTRODUCCIÓN

El uso de la biotecnología reproductiva es fundamental para favorecer los programas de reproducción y mejoramiento genético en la ganadería bovina. En optimización de las herramientas biotecnológicas, algunos trabajos han mencionado el uso de proteínas provenientes del plasma seminal con acción protectora y reparadora del daño celular ocasionado durante los procesos de criopreservación en las células espermáticas (Barrios et al., 2000; Rueda et al., 2013), daño que genera una disminución en el potencial fecundante del semen descongelado (Peris et al., 2007; Sicherle et al., 2011). Entre las proteínas conocidas esta la Osteopontina (OPN), la cual mejora la producción in vitro de embriones, favorece la capacitación espermática, la unión espermatozoide-ovocito, la fecundación y el desarrollo embrionario temprano (Gabler et al., 2003; Monaco et al., 2009; Moura, 2005). La OPN es una glucofosfoproteína secretada extracelularmente, altamente fosforilada, constituida por 314 aminoácidos con un peso molecular entre 44 y 75kDa (Icer y Gezmen-Karadag, 2018). 

En la especie bovina, la OPN tiene 22 aminoácidos menos, lo que se atribuye a la falta de un sitio de unión al Ca²⁺, capaz de generar el potencial de membrana (Prince, 1989) además, se ha descrito que tiene una relación positiva con la fertilidad en los toros, ya que ejerce protección contra infecciones bacterianas en la superficie epitelial de las glándulas accesorias (Cancel et al., 1997).