PCR cuantitativa para la detección del virus de la tristeza de los cítricos en Colombia

Quantitative PCR for detection of citrus tristeza virus in Colombia

Se aplicó la técnica de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qRT-PCR), usando SYBR Green para la detección específica del virus de la tristeza de los cítricos (CTV) en Colombia. Una pareja de iniciadores, diseñados a partir de secuencias conservadas en los marcos abiertos de lectura (ORF’s) 1b y 2, permitió amplificar el ARN genómico (ARNg), y un producto de 186 pb fue obtenido sin la presencia de dímeros o inespecificidad. El análisis de la curva de fusión mostró un pico entre 81 oC y 83 oC, con un coeficiente de correlación de 0,998 y una eficiencia de 99,1%. La curva estándar se desarrolló a partir de una amplificación del producto de 186 pb y permitió realizar un análisis cuantitativo de las muestras, con un rango de detección de 1x10⁸ hasta 1x10³ copias de RNAg y con valores de coeficiente de variación bajos. La acumulación de CTV fue más alta en tejido foliar y en frutos que en corteza; entretanto, las diferencias demostradas entre varias especies de cítricos susceptibles a la infección fueron mínimas. Los resultados de este trabajo muestran que la mayor concentración de virus se encontró en el tercio superior de las plantas analizadas, seguida por el tercio bajo y, por último, el tercio medio. La qRT-PCR es un método específico y sensible de interés práctico en los procesos de detección de las enfermedades virales presentes en el cultivo de los cítricos y otros cultivos de interés comercial.

 1. INTRODUCCIÓN

La citricultura constituye el segundo renglón de importancia económica en el área de la producción de frutas en Colombia, pero enfrenta graves amenazas fitosanitarias debido a la presencia de enfermedades virales y a la alta incidencia de insectos vectores que contribuyen a su propagación (1, 2). El virus de la tristeza de los cítricos (CTV) es el agente causal de la enfermedad viral de mayor impacto económico en este cultivo (3, 4). El amplio espectro de los síntomas provocados por el CTV define la enfermedad como un síndrome, lo que se relaciona con la complejidad de la estructura poblacional de los aislamientos de campo y la existencia de varios genotipos virales distribuidos globalmente (2, 5, 6). El CTV pertenece al género Closterovirus (4, 7, 8); es una partícula flexuosa de 2000 nm de longitud por 11 nm de diámetro, que contiene una sola banda de ArN con sentido positivo, de un tamaño calculado de 20 Kb (4, 9), organizado en 12 marcos abiertos de lectura (ORF’s) (4, 8, 10). El término Tristeza hace referencia al decaimiento foliar que el virus ocasiona en las muchas especies de cítricos que infecta y que han sido injertadas sobre patrones de naranjo agrio (Citrus aurantium) (4, 8, 11). Durante muchos años, el diagnóstico de la infección por CTV fue realizado mediante técnicas como la observación de síntomas; estas pruebas biológicas se realizan a través de la inoculación, preferentemente por injerto de plantas indicadoras, como lima mexicana (Citrus aurantifolia); por métodos serológicos, basados en la reacción de determinantes antigénicos del virus con anticuerpos monoclonales y policlonales; por hibridación molecular con el ADN complementario o por transcripción reversa seguida de la reacción en cadena de la polimerasa (RTPCR) (12, 13).