Discerning Viable from Nonviable Yersinia Pestis pgm- and Bacillus Anthracis Sterne using Propidium Monoazide in the Presence of White Powders

Discernir viables de no viables Yersinia Pestis pgm- y Bacillus Anthracis Sterne usando monoazida de propidio en presencia de polvos blancos

Propósito del estudio

Desarrollar y optimizar un ensayo para determinar el estado de viabilidad de las cepas pgm- de Bacillus anthracis Sterne y Yersinia pestis en presencia de polvos blancos acoplando el tratamiento con monoazida de propidio (PMA) con el análisis de PCR en tiempo real (qPCR).

Enfoque y resultados

Después de entrar en el espacio intracelular, la PMA puede ser exportada por las células metabólicamente activas. La PMA que queda en las células inviables se une al ADN, aumentando así los valores del umbral del ciclo de ensayo (CT) de la qPCR en comparación con las muestras no tratadas. Se optimizó la concentración de colorante, el número y la aptitud de las células, el tiempo de incubación, los métodos de inactivación y el tampón de ensayo para un patógeno Gram-positivo, B. anthracis Sterne, y un patógeno Gram-negativo, Y. pestis pgm-. Las diferencias en los valores de la TC en las células no viables en comparación con las muestras no tratadas fueron consistentemente > 9 tanto para las células vegetativas de B. anthracis Sterne como para las de Y. pestis pgm-, en presencia y ausencia de tres polvos blancos diferentes. Nuestro método elimina la necesidad de un paso de extracción de ADN antes de la detección por qPCR.

Importancia del estudio

El método desarrollado para la detección simultánea y la evaluación de la viabilidad de B. anthracis e Y. pestis puede emplearse en la toma de decisiones sobre la gravedad de una bioamenaza o la seguridad de los alimentos.

Introducción

El Bacillus anthracis es una bacteria Gram-positiva que forma esporas y es el agente causal del ántrax de la enfermedad zoonótica. La infección se produce cuando las esporas acceden al huésped por vía respiratoria, cutánea o gastrointestinal [1]. B. anthracis está listado por el CDC como un agente de bioamenaza de categoría A debido a la estabilidad de la forma de la espora, la infectividad y la facilidad de diseminación. En 2001, la diseminación intencional de las esporas de B. anthracis a través del correo incitaron a los funcionarios de salud pública y a la comunidad científica a mejorar los métodos de detección rápida de los agentes de bioamenaza en general [2]. Como preocupación adicional, el Y. pestis es también una categoría de agente de bioamenaza y es el agente causante de la plaga [3,4]. Dado el potencial de bioamenaza tanto de Y. pestis como de B. anthracis, hemos tratado de desarrollar un método de determinación rápida de la viabilidad de estos dos organismos [4-7].

La necesidad de contar con métodos rápidos para detectar las firmas de ADN de los acontecimientos que se sospecha que constituyen una bioamenaza se ha satisfecho en gran medida con los métodos de PCR en tiempo real (qPCR), que pueden utilizarse para identificar rápidamente las especies bacterianas utilizando sondas específicamente diseñadas.