Downstream processing of recombinant and endogenous proteins from livestock milk

Proceso de recuperación de proteínas endógenas y recombinantes a partir de la leche de ganado

La ingeniería genética ha producido alternativas terapéuticas recombinantes debido a las preocupaciones por la seguridad viral y la demanda clínica de terapéuticos plasmaderivados humanos. Se han empleado varios sistemas de producción que utilizan procariotes, levadura y plantas para producir proteínas recombinantes, pero éstos carecen de la habilidad para producir proteínas con modificaciones bioquímicas complejas, tales como aquellas encontradas en las proteínas dependientes de la vitamina K (VKD). Mientras que el cultivo de células mamarias puede emplearse para fabricar proteínas post-translacionalmente, las bajas densidades de células, y con ello las bajas concentraciones de proteína y los altos costos de equipo de cultivo, hacen que estos productos estén menos disponibles y sean menos económicos. Todos estos sistemas proporcionan una materia prima compleja y desafiante para la tecnología de purificación. En particular, hay un número de fuentes naturales y recombinantes de proteínas terapéuticas que generan la necesidad de tecnología de alta resolución, la cual es económicamente deseable.

Una fuente alternativa de cultivo de células mamarias recombinantes es la glándula mamaria de ganado. La glándula mamaria es naturalmente capaz de producir y secretar grandes cantidades de proteína. De hecho, ya han sido expresadas varias proteínas de ganado transgénico, tales como el activador plasminógeno de tejido en cabras, alfa-1-antitripsina en ovejas, y proteína humana recombinante C(rhPC) en cerdos. La leche es también una fuente de proteínas terapéuticas recombinantes y naturales, tales como las inmunoglobulinas. Mientras que las cabras y las vacas son animales de productos lecheros más clásicos, los cerdos producen casi tanta leche por año como lo hacen las ovejas. El uso de cerdos ofrece a menudo varias ventajas sobre otros animales de ganado lechero, tales como tiempos de generación cortos, aproximadamente 20 crías por año, y cerca de 10 kg de leche por día. De esta forma, existe un número de fuentes naturales y recombinantes de proteínas terapéuticas que generan la necesidad de tecnología de purificación de alta resolución económica.

Con la demanda en crecimiento de proteínas terapéuticas, será una necesidad para las nuevas tecnologías que tienen alto rendimiento de procesamiento, alta producción y alta resolución. En el curso de la investigación, se exploraron tres tecnologías de purificación como nueva tecnología potencial para aislar las proteínas recombinantes y endógenas de la leche : Cromatografía de absorción de lecho expandido (EBAC), combinada con cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC), electroforesis de flujo continuo de reciclaje (RCFE), y enfoque isoeléctrico de flujo libre (FFIEF). El primer proceso, empleado con Zn 2+ como agente precipitante selectivo, purificó. proteína humana recombinante C(rhPC) y IgC (contaminada con menos de 1% de IgA) a partir de leche de puerco, con alta resolución y alto rendimiento, mientras se procesaba entre 10 y 20 gramos en una sola operación.

El segundo proceso (RCFE) fue capaz de aislar las subpoblaciones activas de rhPC a partir de los principales contaminantes de la leche (alfa y beta caseína porcina), así como a partir de subpoblaciones inactivas de rhPC. El proceso RCFE fue capaz de procesar 1.5 g de proteína total por hora. El tercer y último proceso de purificación (FFIEF) subfraccionó 100 mg de rhPC inmuno-purificada en 50 fracciones. El FFIEF fue capaz de producir un gradiente lineal de pH por encima del intervalo de 3-10, empleando 2% de amfolitas. El rhPC fraccionado mostró grados diferentes de actividad que resultaron de ácidos glutámicos gamma -carboxilados y ácidos sialicos.