Estandarización y evaluación de tres sistemas de rep-PCR para la tipificación de Klebsiella pneumoniae

Standardization and evaluation of three rep-PCR systems for typefication of Klebsiella pneumoniae

Para la tipificación de K. pneumoniae se evaluaron los resultados de tres variantes de la técnica de amplificación de secuencias repetidas (rep-PCR) comparándolos con los resultados de la tipificación con electroforesis en gel de campos pulsados (PFGE). Se analizaron dos poblaciones de K. pneumoniae: una constituida por aislamientos causantes de infección nosocomial, recolectados durante un año en un hospital de tercer nivel y otra asociada a un brote intrahospitalario en una unidad de cuidado intensivo neonatal. La tipificación por PFGE se realizó con macrofragmentos obtenidos con Xbal. La rep-PCR se realizó con tres conjuntos de iniciadores correspondientes a las secuencias, BOX, ERIC y REP. Todos los aislamientos fueron tipificables por los tres sistemas rep-PCR y fueron discriminados de manera similar a lo obtenido con PFGE (D = 0.978). El buen poder discriminatorio (D = 0.974) obtenido con los procedimientos rep-PCR estandarizados permite sugerir el empleo de REP-PCR y BOX-PCR para tipificación rápida de aislamientos de K. pneumoniae, aplicada a estudios de epidemiología molecular de la infección nosocomial.

Introducción

Las técnicas microbiológicas convencionales tales como la biotipificación, el análisis de susceptibilidad a los antimicrobianos y algunas otras basadas en el fenotipo, han mostrado limitaciones para la tipificación con fines epidemiológicos de aislamientos bacterianos de origen clínico (1 ), por lo cual en los últimos años se han desarrollado procedimientos basados en el análisis del genoma; entre estos se encuentra la electroforesis en gel de campos pulsados (PFGE) que ha sido considerada, por su excelente poder de discriminación, el estándar de oro de la tipificación bacteriana a nivel de subespecie (2-4). Si bien, la PFGE ha sido aplicada exitosamente en estudios genéticos y epidemiológicos de diferentes organismos, es una técnica laboriosa, requiere de equipos y reactivos costosos y consume mucho tiempo para la obtención de resultados. Como alternativa para la rápida obtención de huellas genómicas se han diseñado diferentes técnicas basadas en la amplificación de ácidos nucleicos, como la rep-PCR (5-7) que agrupa diferentes metodologías basadas en la utilización de iniciadores, diseñados a partir de secuencias repetidas presentes en diferentes especies bacterianas, entre ellas se han referenciado las secuencias repetidas palindrómicas extragénicas (REP), las secuencias consenso intergénicas repetidas enterobacteriales (ERJC) y el elemento BOX, las cuales se encuentran aleatoriamente distribuídas a través del genoma y pueden llegar a ser indicativos de su estructura y evolución (8-10).

Investigaciones previas han demostrado la utilidad de la rep-PCR como una herramienta promisoria para estudios de epidemiología molecular en bacterias Gramnegativas y Grampositivas (5-7). Sin embargo, no se han publicado estudios que muestren la aplicación de estas técnicas en poblaciones del género Klebsiella de origen hospitalario.