Desarrollo y validación de PCR múltiplex con sondas TaqMan para la cuantificación de la dosis génica en cáncer

Development and validation of a TaqMan multiplex PCR assay for the Gene Dosage Quantification in cancer

La evaluación de la dosis génica constituye una herramienta importante para el diagnóstico molecular de enfermedades causadas tanto por la pérdida o amplificación de una región específica de ADN. El cambio en el número de copias génicas, puede conllevar a la pérdida o sobreexpresión de los genes responsables de fenotipo de la enfermedad. El descubrimiento de estas alteraciones y la comprensión de su significado biológico pueden conducir al incremento de las oportunidades terapéuticas en cáncer. La hibridación fluorescente in situ (FISH) es el método de referencia para el análisis de la dosis génica “amplificación”. Sin embargo, presenta algunas limitaciones relacionadas con el costo de las sondas locus específicas; el procedimiento es demorado y las microduplicaciones en tándem podrían no ser detectadas como resultado de la limitada resolución de las metafases. En este sentido, la PCR cuantitativa es una metodología rápida y tiene ventajas en términos de sensibilidad y especificidad. En el presente estudio, se estandarizó la PCR multiplex en tiempo real para el análisis de la dosis génica de los oncogenesEGFR, ErbB2, AKT2, cMYC, MYCN, MYCL1, PI3KCA y REL en líneas celulares tumorales humanas, como una técnica alternativa al FISH para evaluar la dosis génica en muestras clínicas de cáncer.

Introducción

En los mamíferos, la alteración genética del número de copias de los genes por amplificación o duplicación se ha definido como uno de los mecanismos comunes que conducen a la desregulación de la expresión génica y a la transformación neoplásica (1-3). El número de copias de un gen por genoma haploide (dosis génica) se ha analizado tradicionalmente mediante técnicas como Southern blot o hibridación in situ fluorescente (FISH). Sin embargo, estas técnicas pueden no ser apropiadas cuando se trabaja con pequeñas cantidades de material de partida (es decir, tejidos embebidos en parafina, ADN plasmático libre) (9, 10).

La determinación precisa del número de copias de un gen en el genoma (dosis génica) es esencial para una serie de análisis genéticos. La detección cuantitativa por PCR en tiempo real (qPCR) ha mostrado ventajas sobre las técnicas tradicionales de Southern-blot y FISH.

Recientemente, se ha desarrollado un ensayo de PCR en tiempo real que utiliza una sonda TaqMan (una sonda de ADN fluorescente basada en la actividad exonucleasa 5´ a 3´ de la Taq polimerasa) para el análisis cuantitativo del ADN (6). La sonda de oligonucleótidos, con un colorante fluorescente reportero unido a su extremo 5´ y un colorante quencher unido a su extremo 3´, se hibrida con el gen diana. Durante la amplificación de la PCR, el colorante quencher es escindido por la actividad nucleasa 5´ de la Taq polimerasa, dando lugar a la acumulación de fluorescencia reportera. La liberación del colorante fluorescente durante la amplificación permite una rápida detección y cuantificación del ADN (14).