Adaptación y optimización de un método de lectura por fluorometría en el modelo farmacológico in vitro de cultivo de Plasmodium falciparum

Adaptation and optimization of a fluorometric reading method, in the in vitro pharmacological model of Plasmodium falciparum culture

El modelo farmacológico de cultivo in vitro de P. falciparum es crucial en el tamizaje inicial de sustancias o extractos de plantas con posible actividad antiplasmodial. La densidad parasitaria puede determinarse mediante variadas metodologías, sin embargo, se han descrito numerosas ventajas y desventajas asociadas a cada una de ellas. 

Se evaluaron el tiempo de incubación necesario para la tinción y el uso de cultivos asincrónicos o sincrónicos en busca de valores óptimos; evidenciando un tiempo óptimo de 2 h, y límites de detección y cuantificación, menores en cultivos asincrónicos. Empleando las cepas FCR3 y FCB2 se evidenció un ruido de fondo de 12% y 38% respectivamente; la linealidad mostró una buena correlación, r² de 0,9644 (FCR3) y 0,9841 (FCB2) y una pendiente de 1761,8 y 852,4 respectivamente. Además, se comprobó había concordancia entre los métodos, fluorométrico con SYBR Green I (SYBRG I) y microscópico con Giemsa, con diferencia media de 0,00002% y 0,09109% para FCR3 y FCB2 respectivamente. Los límites de detección y cuantificación fueron 0,5% y 1,5% de parasitemia. El factor Z con FCB2 fue 0,376, en tanto que con FCR3 alcanzó 0,702. La concentración inhibitoria 50 (CI₅₀) frente a P. falciparum FCR3, generada por cloroquina (CQ) fue 0,37 mcg/mL por microscopía y 0,35 mcg/mL por fluorometría. 

Nuestros hallazgos sugieren que el ensayo de fluorescencia con SYBRG I, empleando fluorómetros comúnmente disponibles en muchos laboratorios, es preciso, robusto, rápido y exacto; para la evaluación in vitro de sustancias o extractos con posible actividad antiplasmodial.

Introducción

Desde que Trager y Jensen [1] describieron un protocolo para el cultivo in vitro de las etapas eritrocíticas de P. falciparum, y Desjardins [2] propuso su semi-automatización y miniaturización para lograr el crecimiento en placas de microtitulación, el modelo farmacológico in vitro de cultivo de P. falciparum se ha mantenido a la cabeza como técnica de tamizaje primario en la investigación de nuevas alternativas terapéuticas, y el estudio de combinaciones de fármacos frente a la malaria. Este modelo permite emplear el mismo agente que parasita al hombre, además, es relativamente rápido y accesible a muchos laboratorios y no tiene las restricciones éticas que acompañen el trabajo en los modelos de animal integro. Sin embargo, presenta limitaciones de bioseguridad derivadas del empleo de un agente infeccioso que requiere para su crecimiento eritrocitos y plasma humanos.

El modelo requiere de un método de cuantificación de parasitemia asequible y confiable; el método más ampliamente utilizado para evaluar la sensibilidad del parásito a los medicamentos se basa en el examen microscópico de frotis de sangre teñidos con Giemsa, que permite además del conteo de los glóbulos rojos parasitados, la identificación de la morfología del microorganismo; sin embargo, es engorroso, requiere frotis de buena calidad y tiene implícito un sesgo subjetivo (pueden encontrarse diferencias significativas en la parasitemia estimada por diferentes microscopistas); adicionalmente, se han descrito resultados falsos positivos y negativos de más de 36% y 18%, respectivamente, haciéndolo inconveniente para la cuantificación rápida en el tamizaje primario de posibles candidatos a fármacos [3-6].