Análisis proteómico de cultivos primarios de tiroides

Proteomic analysis of primary cultures from thyroid

En el presente estudio se identificaron proteínas de expresión constitutiva, como vimentina, actina, tubulina, proteína de choque térmico de 60 kDa, peroxirredoxina y la ATP sintasa mitocondrial, en cultivos primarios de tiroides normales y de carcinoma papilar de tiroides. Se establecieron las condiciones de extracción, solubilización, análisis cuantitativo y cualitativo de dichas proteínas, y se buscaron las mejores condiciones de isoelectroenfoque (IEF) en la electroforesis en dos dimensiones (2D). 

En la extracción y solubilización de las proteínas se evaluó la presencia o ausencia de anfolitos y sales, se obtuvo un mejor resultado empleando en el amortiguador de extracción sales como Tris-HCl y acetato de magnesio que incrementan la solubilidad de las proteínas. Para la cuantificación se recomienda el uso conjunto de técnicas colorimétricas con la electroforesis SDS-PAGE tiñendo con azul de Coomassie y corroborando los resultados mediante western blot, lo cual permite, además, verificar la integridad de las proteínas. 

Respecto a la electroforesis en dos dimensiones, se obtuvieron geles con un mayor número de manchas (spots), resueltos, enfocados y reproducibles empleando en el IEF gradientes inmovilizados de pH de 4-7 y voltaje final de 8.000 V. Las proteínas se identificaron mediante el análisis bioinformático de los geles 2D con el programa PDQuest (PDQuest 7.2, Bio-Rad®) y MALDI-TOF.

INTRODUCCIÓN

La proteómica estudia el proteoma, entendido como el conjunto de proteínas que se expresa a partir de un genoma, así como sus modificaciones (fosforilación, acetilación, ubiquitinación, entre otras), y provee información acerca de la abundancia, localización e interacciones entre proteínas (1, 2).

En muchos casos no son los cambios en los genes los que dan lugar a la enfermedad, sino alteraciones en los niveles de traducción y modificaciones postraduccionales de las proteínas que en últimas determinan la función biológica. Por esta razón, en los últimos años se han venido desarrollando técnicas que permitan la búsqueda de biomarcadores para la detección de las enfermedades en estadios tempranos, basadas en la identificación de proteínas que están sobreexpresadas o modificadas como consecuencia del propio proceso de la enfermedad.

Existe gran variedad de técnicas para identificar y comparar la abundancia de las proteínas, así como también para determinar modificaciones postraduccionales, localización subcelular e interacciones moleculares, como son la cromatografía líquida, la electroforesis en dos dimensiones (2D), acoplada a espectrometría de masas, y ensayos con anticuerpos, entre otros (3). Dentro de las aplicaciones más ampliamente extendidas de la electroforesis en 2D destacan la identificación a gran escala de proteínas (proteómica global) y el estudio de las diferencialmente expresadas (proteómica diferencial) (4).