Condiciones para el análisis electrofóretico de proteínas apoplásticas de tallos y raíces de clavel (Dianthus caryophyllus L) para estudios proteómicos

Electrophoretic conditions for analysis of apoplastic proteins in stems and roots of carnation (Dianthus caryophyllus L) for proteomic studies

En el presente estudio se describe un flujo de trabajo que puede ser aplicado a diferentes especies vegetales, con el fin de obtener extractos apoplásticos que puedan ser usados para análisis proteómicos. Para ello, usando tallos y raíces de clavel, se evaluaron parámetros claves para la extracción de estas proteínas. Se determinó que para esta especie (Dianthus caryophyllus L) se debe usar la solución amortiguadora fosfato de sodio 0,1 M pH 6,5, cloruro de sodio 50 mM y 0,1% β-mercaptoetanol para la infiltración; con tres tiempos de vacío de 20 s a 70 kPa y centrifugación a 1000 x g durante 20 min a 4 ºC, seguido de precipitación y concentración de proteínas con el método (TCA-Ácido tricloroacético)/acetona. Bajo estas condiciones, se obtienen extractos que permiten análisis electroforéticos en 2D de proteínas de apoplasto, usando para el isolectroenfoque tiras con gradientes de pH 5-8 para raíz y pH 3-10 para tallo. Las condiciones descritas permitirán profundizar sobre el papel de las proteínas apoplásticas en diversidad de fenómenos biológicos que involucren esta especie vegetal.

Introducción

El apoplasto de la planta, compuesto por la matriz de la pared celular y los espacios intercelulares, juega un papel importante en una amplia gama de procesos fisiológicos: interacción celular, transporte de agua y nutrientes, interacciones planta-patógeno, percepción y transducción de señales ambientales, entre otros (1, 2). La llegada delos fitopatógenos al apoplasto vegetal es una fase crítica en la mayoría de las enfermedades infecciosas, pues es donde se presentan los  primeros  eventos  que  determinan  la  susceptibilidad  o  la resistencia (1). Durante la activación de los mecanismos de defensa de las plantas, se requiere la regulación de una amplia variedad de proteínas que están implicadas en el fortalecimiento de la pared celular y en diversos niveles de la percepción y degradación de patógenos. La regulación fina de dichas proteínas presentes en el apoplasto de la planta es esencial para una rápida y efectiva percepción del patógeno, lo que conduce a mantener la integridad dela pared celular de la planta(3-5).