Purificación del fibrinógeno gamma A/gamma prima (γA/γꞌ) por cromatografía líquida rápida de proteínas

Purification of fibrinogen gamma A/gamma prima (γA/γꞌ) by fast protein liquid chromatography

Una fracción del fibrinógeno circulante contiene una variante de la cadena γ que se origina por empalme alternativo del ARNm, denominada γ’ cuya concentración en plasma se ha relacionado con un incremento en el riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares. Por tanto, el objetivo de este trabajo fue diseñar un método de purificación del fibrinógeno γA/γ’ más eficiente en relación a los descritos en la literatura, a partir de plasma humano. Se purificó el fibrinógeno γA/γ’ a partir del fibrinógeno total obtenido por precipitación con β-alanina, mediante la separación por cromatografía líquida rápida de proteínas. Se confirmó la presencia de fibrinógeno γA/γ’ mediante Western blot; su concentración fue determinada por ELISA. El método mostró ventajas en comparación con los métodos clásicos de separación, por ejemplo, que cantidades menores de muestra pudieron ser fraccionadas cuantitativamente en componentes puros en menor tiempo (30 min). Por tanto, se puede concluir que la técnica utilizada para la purificación de las variantes del fibrinógeno, correspondiente al Fg gA/gA y Fg gA/g’, es un método de separación eficiente que permite purificar el Fg gA/g’ libre de contaminantes principales, como lo confirma la inmunoelectroforesis.

Introducción

El fibrinógeno (Fg) es una glicoproteína plasmática sintetizada por los hepatocitos [1]. En la etapa final de la coagulación de la sangre, la trombina convierte el Fg soluble en monómeros de fibrina que posteriormente polimerizan y forman la fibrina insoluble, por acción del Factor XIII (FXIIIa). La transglutaminasa es activada fisiológicamente por la trombina en presencia de calcio [2, 3]. El Fg está formado por tres pares de cadenas polipeptídicas distintas (Aα, Bβ, y γ)₂. Una variante de la cadena γ normal (γA) o la más abundante del Fg se produce por empalme alternativo del ácido ribonucleico mensajero (ARNm), llamado gamma prima (γ’) [4, 5]. Esta variante constituye un sitio de unión a la trombina de alta afinidad [6]. En la variante de Fg γA/γ’ los últimos cuatro aminoácidos del extremo carboxi-terminal, alanina, glicina, aspártico y valina (AGDV), son reemplazados por una secuencia de 20 aminoácidos γ’408-427, VRPEHPAETEYDS LYPEDDL. Los dos residuos de tirosina están sulfatados y hay tres residuos de ácido aspártico y cuatro de ácido glutámico, los cuales le confieren a esta variante un fuerte carácter electronegativo [7, 8]. Esta propiedad ha permitido separar por cromatografía de intercambio aniónico estas dos poblaciones del Fg [9]. A pH neutro, el Fg eluye con las dos cadenas γA (γA/γA) (pico 1; homodimérico), mientras que a pH mucho más ácido (tres órdenes de magnitud) eluye con las cadenas γA y γ’ (γA/γ’; heterodimérico).