Estandarización de una PCR anidada para la identificación de Lawsonia intracellularis en porcinos

Standardization of a nested PCR for the identification of Lawsonia intracellularis in swine

Se estandarizó una técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa PCR anidada para el diagnóstico de la enteropatía proliferativa porcina causada por la bacteria Lawsonia intracellularis. La técnica se basó en la amplificación de una región de 270 pb del gen 16s arnr de Lawsonia intracellularis; para tal fin, se extrajo el adn de la bacteria mediante el kit Purelink Genomic, Invitrogen^®, a partir de 100 muestras de íleon de porcinos provenientes del área metropolitana de Bucaramanga (Santander). Los adn fueron cuantificados por fluorometría y ajustados a una concentración de 20 ng/µL. Se llevó a cabo una primera amplificación de la porción de 319 pb del gen 16s arn con los iniciadores externos: 5’-tat ggc tgt caa aca ctc cg-3’ y 5’-tga agg tat tgg tat tct cc-3’. El producto de esta primera amplificación se usó de molde para una segunda reacción, en la que se amplificó una porción interna de 270 pb del gen 16s arn de L. intracellularis, empleando los iniciadores internos específicos: 5’-tta cag gtg aag tta ttg gg-3’ y 5’-ctt tct cat gtc cca taa gc-3’. Las condiciones óptimas para las pcr tanto con los iniciadores internos como con los externos incluyeron: 2,5 mm de mgcl₂; 0,15 mm de cada dntp; 1x de Buffer de reacción; 0,8 µm de cada iniciador; y 2,5 U de Taq polimerasa. Como control positivo tanto en la extracción de adn como en las pcr, se empleó ADN bacteriano extraído de la vacuna Enterisol^® (Boheringer Ingelheim^®). Las temperaturas óptimas de anillamiento para la pcr simple y anidada fueron de 50 y 55°C, respectivamente. El límite de detección de la técnica fue de 5 fg. La técnica no evidenció reacción cruzada con Esquerichia coli, ni con Salmonella typhimurium, bacterias con cuadros clínicos semejantes.

INTRODUCCIÓN

La industria porcina se enfrenta constantemente a enfermedades gastrointestinales, que son responsables de generar pérdidas económicas tanto en las fases de destete como de finalización. En tiempos recientes, se ha trabajado en las características genotípicas de virulencia de los patógenos, así como en las posibles medidas profilácticas para evitar los efectos lesivos resultantes de la invasión y replicación directa sobre la mucosa intestinal de bacterias como Lawsonia intracellularis [1].

L. intracellularis es una bacteria intracelular que causa enteritis proliferativa porcina (epp), infección reportada en América con prevalencias superiores al 30%. El impacto económico generado por entidades gastrointestinales del tipo de la ileítis porcina puede ser importante en países como Brasil, Chile, Argentina, Colombia, Paraguay y Venezuela; considerados los de mayor producción oficial en Suramérica [2, 3, 4]. En Colombia, por técnicas serológicas y tinción de plata, se describen prevalencias del 20-87%, principalmente en Antioquia y Cundinamarca. En la industria porcícola santandereana no existen reportes que aproximen una información actual sobre la situación de la epp desencadenada por esta bacteria. La presente investigación optimizó una técnica de pcr anidada, útil para el futuro diagnóstico y conocimiento de la situación epidemiológica de la L. intracellularis en el departamento de Santander.