Aislamiento de clones con actividad Endo-b-1,4-glucanasa a partir de un segmento de ADN de 13kb de Clostridium sp IBUN22A

Isolation of clones with Endo-b-1,4-glucanase activity from a 13kb DNA segment of Clostridium sp IBUN22A

La producción de combustibles, solventes y algunos productos químicos a partir de sustratos celulósicos usando microorganismos ofrece una ventaja frente a los de origen fósil. Un acercamiento prometedor ha sido la implementación de ingeniería genética utilizando genes de enzimas involucradas en la degradación de desechos celulósicos. En la última década se han generado bibliotecas genéticas para proveer enzimas celulolíticas, que hagan el proceso más rentable, lo cual permitiría aprovechar mejor residuos celulósicos disponibles. Este trabajo describe el aislamiento de dos fragmentos de ADN que expresan actividad endo-β-1,4-glucanasa, a partir de un segmento ADN de 13Kb (clon 02080-25) aislado de una biblioteca genómica de la cepa nativa Clostridium sp IBUN22A. El aislamiento de la región codificadora se realizó a través de pruebas de inducción de la actividad, análisis por restricción del segmento y construcción de una sub-biblioteca con la enzima Sau3A I. 325 clones fueron obtenidos, de los cuales 271 tenían inserto. El tamizaje molecular de estos últimos mostró que siete clones presentaron tamaños entre 3500pb y 7000pb y el tamizaje enzimático con carboximetilcelulosa como sustrato permitió el aislamiento de los clones pBSh-37 y pBSh-26 con la actividad endo-β-1,4-glucanasa original, de tamaños de inserto de 627pb y 879pb respectivamente. Este trabajo es el punto de partida para el aislamiento de enzimas de alto potencial biotecnológico.

INTRODUCCIÓN

La celulosa es un polímero distribuido ampliamente en la naturaleza; su conversión es uno de los procesos más atractivos debido a su gran potencial como fuente segura y renovable de combustibles (Doi Roy H. et al., 2003). La barrera principal para su explotación ha sido la ausencia de tecnología de bajo costo que permita convertir un compuesto recalcitrante como la celulosa en biomasa disponible. Una estrategia promisoria involucra la producción de enzimas celulolíticas, hidrólisis de biomasa y fermentación en una misma vía para generar azúcares o productos deseados por medio de microorganismos celulolíticos individuales o por medio de un consorcio de éstos (Lynd Lee R et al., 2002).

Los clostridios celulolíticos son bacterias anaerobias, esporoformadoras que producen celulasas, ya sea independientemente o en complejos enzimáticos conocidos como “celulosomas” (Bayer et al., 1998). En los últimos años se ha trabajado en el aislamiento y clonación de genes celulolíticos, mediante la construcción de bibliotecas genómicas, en las cuales el ADN cromosomal de Clostridium es digerido con Sau3A I y recombinado con vectores digeridos en el sitio BamH I (Peterson et al., 1991).